0931-7328466 139194453350931-7328466 139194453351、什么是高效液相色谱仪？高效液相色谱仪是一种采用分离与分析技术的仪器，其特点是以液体作为流动相，固定相可以有多种形式，如纸、薄板和填充床等。在色谱技术发展的过程中．为了区分各种方法，根据固定相的形式产生了各自的命名，如纸色谱、薄层色谱和柱液相色谱。2、高效液相色谱仪介绍高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。3、高效液相色谱仪原理高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。简单的说，就是样品溶解在流动相中，随流动相进入色谱柱，经过固定相（填料）时，会受到固定相的吸附。样品中不同组分受到的吸附不同，于是流出色谱柱的时间顺序就不同。如果是反相色谱，固定相（硅胶烷烃填料)极性 小于 流动相(乙腈、甲醇等溶液）。样品中的各组分，极性小的受到的固定相吸附力就比较大，较晚流出色谱柱，体现在谱图中及出峰较晚。正相色谱则相反。HPLC是高压输送流动相，快速、高效分离的液相色谱法。（通常用的最多的是第二种，即分配平衡，）色谱分离原理高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。（1）．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。（2）．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、Tetrahydrofuran、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、Tetrahydrofuran等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法 反相色谱法固定相极性 高～中 中～低流动相极性 低～中 中～高组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。（3）．离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。（4）．离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、Three FLUOROACETIC acid 也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈。4、高效液相色谱仪的作用主要是用于定量组分分析用，简单的说，就是能能准确的知道单位体积内含有多少某一种或某几种物质的量，也能比较准确的分析混合物中含有那些物质或那一类物质。高效液相色谱仪应用很广泛，基本能对有机化合物中百分之七十到百分之八十的化合物进行分离与检测，下面以安捷伦液相色谱技术做为举例：应用液相色谱用途广泛，已经成为大多数化学行业和生命科学行业中的标准配置。安捷伦液相色谱和液－质联用系统正为各种客户群服务，如药物研制和生产、蛋白质、食品安全、环境、国土安全和石油化工等市场。随着新应用和改进应用的开发，液相色谱的市场增长很快，包括制药和生命科学市场，中国和印度增长势头尤为强劲。制药：制药行业是安捷伦高效液相色谱仪和液－质联用系统的主要用户。从药物研制到开发、制造和QA/QC，液相色谱在药物的整个生命周期中发挥着重要作用。它使得科学家能够迅速进行筛选、纯化的分析工作。液相色谱和液－质联用系统也是用来检查药物化合物质量和数量的主要工具，它在法规环境中使用固定方法，为药物制造提供支持。蛋白质：液相色谱和液－质联用系统正在不断增长的一个市场机会是识别、隔离和净化细胞和体液中的蛋白质。液相色谱用途广泛，为分析蛋白质和其它生物分子提供了理想的技术，包括大的、非常灵敏、分析困难的蛋白质和生物分子。环境：安捷伦的客户主要是重点满足和实施法规标准的政府实验室、工业实验室和独立实验室。液相色谱和液－质联用系统分析包括非挥发性杀虫剂、除草剂、多核芳香碳氢化合物及不适合气相色谱的其它化合物。食品安全：食品安全分析包括检测农产品和食品中的添加剂、残留物、杂质和毒素，其主要重点是满足和实施法规标准。在全球贸易自由化、法规监管环境不断完善及食品安全问题的公众意识不断提高的情况下，食品分析需求正在迅速增长。法律医学：安捷伦科技是用于药物筛选和毒理学研究的气相色谱/质谱仪系统的全球领导型供应商。作为气相色谱/质谱设备的补充，安捷伦的液相色谱/质谱系统已开始被应用于法医分析。电感耦合离子质谱与激光切除的结合对于法医调查中固体样品以及基本元素图谱的测量也非常有效。国土安全：安捷伦长期以来一直与美国和国际政府、军事、司法和卫生机构合作，检测、识别、确认和消除生物和化学战争制剂及有毒的工业化合物。石油化工(HPI)：高效液相色谱仪应用包括添加剂化验、精细和专用化学分析以及使用带有有机溶剂或水性溶剂的大小排查色谱检定聚合物。半导体：安捷伦为半导体制造过程中超高纯度材料的分析提供了的创新型和高可靠型电感耦合离子质谱仪。电感耦合离子质谱仪的主要应用包括半导体制造过程中散装和过程化学品的特性分析、硅片表面有机及金属污染物分析、最终部件（磁盘驱动器，电路板等）制造过程中挥发性有机溶剂的分析。5、高效液相色谱仪操作步骤（1）、过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。 （2）、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 （3）、打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 （4）、进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 （5）、有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。 （6）、调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 （7）、设计走样方法。点击file，选取selectusersandmethods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击newmethod。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 （8）、进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 （9）、关机时，先关计算机，再关液相色谱。 （10）、填写登记本，由负责人签字。6、使用高效液相色谱仪注意事项 （1）、流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 （2）、柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 （3）、所有过柱子的液体均需严格的过滤。 （4）、压力不能太大，不要超过2000psi7、液相色谱仪价格：1290 Infinity II 液相色谱仪1290 Infinity II 液相色谱仪 参考成交价格： 11.2万元[美元] 安捷伦, 效率优先，最大化分析效率、仪器效率、实验室运营效率ACQUITY Arc UHPLC超高效液相色谱仪ACQUITY Arc UHPLC超高效液相色谱仪 参考成交价格： 8.98万元[美元] 沃特世, 四元溶剂管理UHPLC，HPLC和UHPLC方法切换简单，帮助用户从HPLC过渡到UPLCVanquish flex UHPLC超高效液相色谱仪Vanquish flex UHPLC超高效液相色谱仪 参考成交价格： 8万元[美元] 赛默飞, 四元泵，耐压15000psi最高流速达8mL/min，控温准确，增加荧光检测器Nexera UC 在线SFE/SFC色谱系统Nexera UC 在线SFE/SFC色谱系统 参考成交价格： 11.52万元[美元] 岛津, 是LC，GC & SFC 等分析模式统一的新技术，同时也是样品制备和分离统一的新技术iChrom5100系列高效液相色谱仪iChrom5100系列高效液相色谱仪 参考成交价格： 15~25万元[人民币] 依利特, 高集成度的ARM微控制器及SPI、I2C总线技术，灵活实现LAN及RS485通讯方式LC-100plus 二元高压高效液相色谱仪LC-100plus 二元高压高效液相色谱仪 参考成交价格： 7.65~10.85万元[人民币] 伍丰, 数字化电脑智能全控，稳定，方便，外观新颖8、高效液相色谱仪常见故障分析故障1：流动相内有气泡，关闭泵，打开排空阀，按PURGE键清洗脱气，气泡不断的从过滤器冒出，进入流动相，无论打开PURGE键几次，都无法清除不断产生的气泡。原因：过滤器长期沉浸于水液内，过滤头内部由于霉菌的生长繁殖，形成菌团阻塞了过滤器，缓冲液难以流畅的通过过滤头，空气在泵的压力下经过过滤器进入流动相.处理过滤头浸泡在5%的硝酸溶液内，超声清洗十五分钟即可；亦可将过滤头浸泡在5%的硝酸溶液中12～36小时，轻轻震荡几次，再将过滤器用纯水清洗几次，打开排空阀，打开PURGE键清洗脱气如仍有气泡不断从过滤器冒出，继续将过滤器浸泡在5%硝酸溶液中，如没有气泡不断从过滤器冒出,说明过滤器内部的霉菌菌团以被硝酸破坏,流动相可以流畅的通过过滤器，打开排空阀，打开泵流速调治1.0～3.0mL/min，纯水冲洗过滤器1小时左右，即，可将过滤器清洗干净。关闭泄压阀，纯甲醇冲洗半小时即可。故障2：柱压高；原因：(1)缓冲液盐份如，乙酸铵等，沉积柱内；(2)样品污染沉积：处理对于第一种情况先用40～50度的纯水，低速正向冲洗柱子待柱压逐渐下降后，相应的提高流速冲洗柱压大幅度下降后，用常温纯水冲洗，之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟，对于第2种情况，由样品的沉积引起污染的C18柱，和纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇[4+6]冲洗柱子[冲洗时间的长短由样品的污染情况而定]，在用换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，最后甲醇冲洗，正向冲洗柱子30分钟以上。 故障3：既无压力指示又无液体流过 原因： 1.泵密封垫圈磨损； 2.大量气体进入泵体： 处理对于第一种情况,更换密封垫圈，对于第二种情况,在泵作用的同时，用一个50mL的玻璃针筒在泵的出口处不帮助抽出空气。 故障4：压力波动大，流量不稳定。 原因： 系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间家有异物，使得两者不能密封； 处理：工作中注意流动相的量，保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底，避免吸入空气，流动相要充分脱气，如，为单向阀和阀座之间夹有异物，拆下单向阀，放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗。 故障5：出峰不准，峰分叉。高效3.jpg 原因： (1)色谱柱被污染； (2)柱头填料塌陷： 处理对于第一种情况,先用纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定)，再换成甲醇冲洗，然后，再用纯水冲洗，最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上，如，冲洗后依然出峰不佳，则考虑第二种情况。对于第二种情况，拧开柱头，检查柱填料是否硬结或塌陷，去除硬结部分(污染的填料)，装入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用与助内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧，再填平，滴甲醇，再压紧反复几次，直至装满填平。柱头用甲醇冲洗干净，擦净柱外壁的填料，拧紧柱头，用纯甲醇冲洗30分钟以上。 故障6：峰面积重复性不佳。 原因： （1）进样阀漏夜； （2）加样针不到位： 处理： 对于第一种情况更换进样垫圈；对于第二种情况保证加样针插到底，注射样品溶液后须快速，平稳地从LOAD状态转换到INJECT状态，以保证进样量的准确。日常生活中，液相色谱仪的保养非常重要，如要注意不要让空气进入输液系统和高压泵中，储液器内的溶液如时间未用应清洗储液器并更换溶液，每次用完色谱仪后缓冲溶液要用纯水冲洗干净，防止无机盐析出或沉积；样品的前处理也很重要，任何样品都要尽可能地去除杂质，完全溶解，尽量减少对色谱柱的污染，以延长色谱住的使用寿命，同时，避免注射过量浓的样品溶液，以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞；色谱住作好标记，用于不同分析目的的色谱住不要混用等。高效2.jpg 上文的知识就是小编为大家分享的高效液相色谱仪原理与用途、特点与故障原因及处理方法，希望大家可以有所收获。高效液相色谱仪在使用的过程中会出现很多的问题，如果操作者可以了解故障的原因，就可以很好的去预防和排除这些故障，并且可以为正确使用该仪器使其发挥出最大的性能。原文链接结构清晰图文并茂：http://www.hz-rush.com/zhishi/1096.html
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